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高灵敏度支原体检测试剂盒说明书

作者:上海翼和应用生物技术有限公司 2023-10-25T00:00 (访问量:27566)

高灵敏度支原体检测试剂盒说明书

【产品规格】

BPMPro100 100 Reactions/盒

【产品说明】

支原体(Mycoplasma):目前发现的最小原核生物,据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能,易致实验结果不稳定,须对培养细胞定期进行支原体检测。

本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液,细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点:

灵敏:配合推荐使用的核酸抽提方案,检测灵敏度达到10CFU/ml。

可靠:抽提加入内标核酸,全过程质量控制。

稳定:全程闭管操作,无交叉污染。

方便:操作简单,无需电泳步骤。

【有效期】

规定储存条件下6个月。

-20 ℃取出后,可避光存放于4 ℃继续使用1周。

【产品组分】

表1 产品组分

组分名称 装量 储存条件
Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 475 ul×2管 -20 ℃,避光
Biowing®MyPrimer&Probe Mix2 25 ul×2管 -20 ℃,避光
阳性质控(PC) 50 ul×2管 -20 ℃
内部质控(IC) 50 ul×2管 -20 ℃
RNase Free Water 50 ul×2管 -20 ℃
石蜡油 750 ul×2管 -20 ℃

注:

1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。

  1. 内部质控含有内标DNA。

在实验前请完整阅读本说明书,务必重视注意事项和无菌操作规范!

【操作步骤】

1.样本制备

  1. 样本的标准制备方案:请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA,作为模板进行 qPCR 反应。
  2. 前处理阴性样本准备方案:将RNase Free Water当成样本,加入内部质控,进行核酸抽提。
  3. qPCR 反应液的准备
    1. 根据所要检测样品的数量,计算所需反应孔数,每个样本做3个重复孔。
      反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3
    2. 根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量(需有1孔的加样损失量):
      Mix =(反应孔数+1)×10 μl
    3. 各试剂放室温融化,并根据下表所示准备 qPCR Mix:
      表2 qPCR Mix的配制
组分/样品管 Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 (µL) MyPrimer&Probe Mix2(µL) 总体积(µL)
1人份 9.5 0.5 10
N人份 9.5N 0.5N 10N

 

  1. 加样

(1)震荡混匀 qPCR Mix,低速离心,将管盖残留液体收集至管底。

(2)向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。

(3)向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。

(4)向反应管中加入样品后短暂离心,加样示例如下:

表 3 加样示例

PCR模板 qPCR Mix 总体积
PC 20 μL 10 μL 30 μL
qPCR 阴性20 μL 10 μL 30 μL
前处理阴性20 μL 10 μL 30 μL
样本A重复1 20ul 10 μL 30 μL
样本A重复2 20ul 10 μL 30 μL
样本A重复3 20ul 10 μL 30 μL

【注】:此时每个反应孔的体积为30μL。

qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。

PCR 仪设置以 ABI 7500 为例,相对定量模式,选择

TaqMan 探针法:

步骤 循环数 温度 时间
1 预变性 1 94℃ 5 min
2 变性 15 95℃ 10 s
退火与延伸 65℃ 90 s
3 变性 25 95℃ 10 s
退火与延伸 65℃ 30 s
65℃延伸时收集荧光信号
通道选择:样本检测通道-FAM;内参检测通道-HEX,无HEX 通道,可使用VIC 通道。ABI 系列荧光定量 PCR 仪需 ROX 校准,Passive reference 选择ROX。

注:1、该程序为两阶段扩增法,如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光,按照正常Ct值判断结果;如果只能最后一步收集荧光,需要在原数据的基础上加15个Ct值。

  1. ROX设置是以7500为例,但也存在例外,例如StepOne。

【阈值设置】

以ABI 7500 为例,扩增曲线选择 log 法,如果不能两阶段收集荧光,基线设置1~2个循环;如果可以,基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。

  1. 内参(HEX/VIC)阈值设定:以阳性对照定内参扩增曲线阈值,将内参的Ct 值定为 28±2。
  2. 支原体(FAM)阈值设定:以阳性对照定支原体扩增曲线阈值,将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。

【实验质量控制】:

如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30,但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常,表明阳性支原体对照模板有降解。

如果样品前处理阴性的内参(HEX/VIC)Ct 值>30,阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ,表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。

【结果判读】

根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定,具体标准如下:

PCR 模板 支原体(FAM)Ct 值 内标(VIC) Ct 值 判定说明
阳性对照 ≤30 阳性成立
>30 阳性不成立
qPCR阴性对照 ≥37.5 ≥37.5 阴性成立
<37.5 <37.5 阴性不成立
样本前处理阴性 ≥37.5 ≤30 阴性成立
待测样品反应孔 <37.5 ≤30 阳性
≥37.5 ≤30 阴性

要求每个检测样品做3重复,如果3复孔中,两重复为阳性,则判读为阳性;建议做样本前处理阴性,可以质控整个抽提过程。

注:检测结果异常时:

  1. 样品前处理阴性:内参Ct值过大,表明抽提效率低;支原体检测通道Ct值小于37.5,可能前处理抽提过程存在污染。
  2. qPCR阴性:支原体和内参检测通道Ct值小于37.5,操作过程存在污染。
  3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。

【 PCR过程注意事项】

由于 PCR 反应非常灵敏,实验操作中应注意以下事项,以免发生DNA 污染:

  1. 试剂盒开启后,阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。
  2. 每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀,避免起泡,并低速短暂离心后使用。
  3. 要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。
  4. 建议自备转运盒,用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。
  5. 建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
  6. 建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台,样本的加样在另外一个无菌操作台。
  7. 建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照,并使用带滤芯的枪头进行加样。
  8. 应按照先加阴性,再加样本,最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。
  9. qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。
  10. 上机扩增前,反应管短时低速离心,将管壁液体收集至管底
  11. 盖上反应管盖子或者贴上光学膜后,为避免影响荧光信号读取,请注意不要在管盖或者膜上做标记,或者用刮板反复摩擦。
  12. 本产品仅作科研用途。

【附录 1 可检测支原体种类】

序号 拉丁文系统名 序号 拉丁文系统名
1 Acholeplasma hippikon 46 Mycoplasma orale
2 Acholeplasma laidlawii 47 Mycoplasma ovipneumoniae
3 Acholeplasma oculi 48 Mycoplasma oxoniensis
4 Acholeplasma pleciae 49 Mycoplasma penetrans
5 Candidatus Mycoplasma girerdii 50 Mycoplasma phocicerebrale
6 Mycoplasma alkalescens 51 Mycoplasma phocidae
7 Mycoplasma alvi 52 Mycoplasma pirum
8 Mycoplasma anseris 53 Mycoplasma pneumoniae
9 Mycoplasma anserisalpingitidis 54 Mycoplasma pulmonis
10 Mycoplasma aquilae 55 Mycoplasma salivarium
11 Mycoplasma arginini 56 Mycoplasma sp. Phocoena
12 Mycoplasma arthritidis 57 Mycoplasma sphenisci
13 Mycoplasma auris 58 Mycoplasma struthionis
14 Mycoplasma bovoculi 59 Mycoplasma sualvi
15 Mycoplasma buccale 60 Mycoplasma subdolum
16 Mycoplasma canadense 61 Mycoplasma synoviae
17 Mycoplasma cloacale 62 Mycoplasma testudineum
18 Mycoplasma conjunctivae 63 Mycoplasma testudinis
19 Mycoplasma crocodyli 64 Mycoplasma timone
20 Mycoplasma dispar 65 Mycoplasma todarodis
21 Mycoplasma elephantis 66 Mycoplasma tullyi
22 Mycoplasma enhydrae 67 Mycoplasma verecundum
23 Mycoplasma equigenitalium 68 Mycoplasma vulturii
24 Mycoplasma falconis 69 Mycoplasma zalophi
25 Mycoplasma faucium 70 Mycoplasmopsis agassizii
26 Mycoplasma felis 71 Mycoplasmopsis alligatoris
27 Mycoplasma flocculare 72 Mycoplasmopsis anatis
28 Mycoplasma gallisepticum 73 Mycoplasmopsis arginini
29 Mycoplasma gateae 74 Mycoplasmopsis bovirhinis
30 Mycoplasma genitalium 75 Mycoplasmopsis canis
31 Mycoplasma gypis 76 Mycoplasmopsis citelli
32 Mycoplasma hominis 77 Mycoplasmopsis columbinum
33 Mycoplasma hyopharyngis 78 Mycoplasmopsis cricetuli
34 Mycoplasma hyorhinis 79 Mycoplasmopsis cynos
35 Mycoplasma hyosynoviae 80 Mycoplasmopsis edwardii
36 Mycoplasma imitans 81 Mycoplasmopsis felis
37.5 Mycoplasma indiense 82 Mycoplasmopsis fermentans
38 Mycoplasma leocaptivus 83 Mycoplasmopsis gallinacea
39 Mycoplasma leonicaptivi 84 Mycoplasmopsis mustelae
40 Mycoplasma lipophilum 85 Mycoplasmopsis pullorum
41 Mycoplasma marinum 86 Mycoplasmopsis pulmonis
42 Mycoplasma moatsii 87 Mycoplasmopsis verecunda
43 Mycoplasma mobile 88 Ureaplasma diversum
44 Mycoplasma nasistruthionis 89 Ureaplasma felinum
45 Mycoplasma neophronis 90 Ureaplasma urealyticum

【附录 2 适用荧光定量 PCR 仪品牌型号】

序号 生产商 机器型号
1 ABI 7500
2 ABI 7500 Fast DX
3 ABI StepOnePlus
4 ABI QuantStudio5
5 ABI StepOne
6 ABI QuantStudio7
7 ABI VIVA7
8 ABI QuantStudio 3
9 Roche Roche LightCycler96
10 Roche Roche LightCycler480
11 Biorad Bio-Rad CFX96
12 宏石 SLAN-96S/48P

注:适用荧光定量PCR 仪为迄今为止我们客户配备的定量仪器品牌型号,如您的荧光定量 PCR 仪不在我们列出的范围,也欢迎联系我们,申请试用。

如有技术问题,欢迎电话咨询:021-33559491

【附录 3 高灵敏度支原体 DNA 提取纯化试剂盒(柱式法)说明书】

本公司推荐QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit (50)

货号: 50214

  • 试剂盒简介
    支原体 DNA 提取纯化试剂盒(柱式法)用于提取纯化生物样品中的微量支原体 DNA,与高灵敏度支原体检测试剂盒(PCR-荧光探针法)配套使用,参照EP2.6.7 和 JPXVII 支原体检测相关要求进行验证。
  • 试剂盒组分
    表 1. 试剂盒组分
组份 装量 储存条件
Collection Tubes (2 ml) 50个×1 袋 室温
Elution Tubes (1.5 ml) 50个×1 袋 室温
UCP Mini Columns 1个×50 2~8℃
Buffer ATL 38ml×1 瓶 室温
Buffer APL2 14ml×1 瓶 室温
Buffer APW1 18ml×1 瓶 室温
Buffer APW2 15ml×1 瓶 室温
Buffer AVE 1.9ml×8管 室温
Proteinase K 2.5ml×1 瓶 2~8℃

注:在室温(15-25℃)下储存,蛋白酶K可稳定达1年。延长蛋白酶K的寿命,建议储存在2-8℃。
在实验前请完整阅读本说明书,务必重视注意点!

  • 实验准备
    开启新试剂盒时需完成以下工作:
    • 将样品置于室温(15–25°C)平衡。
    • 将Buffer AVE置于室温平衡。
    • 配制Buffer APW1:使用前,将24 ml乙醇(96-100%)加入18 ml Buffer APW1浓缩液中,得到42 ml Buffer APW1。加入乙醇后震荡混匀。
    • 配制Buffer APW2 :使用前,将35 ml乙醇(96-100%)加入15 ml Buffer APW2浓缩液中,得到50 ml Buffer APW2。加入乙醇后震荡混匀。
    • 如果Buffer ATL或Buffer APL2中形成沉淀,应56 ℃水浴或金属浴,待完全溶解后,震荡混匀。
    • 准备好 2个水浴或金属浴温度,56 ℃、70 ℃。
      在样品准备时需要注意以下几点:
    • 阴性对照(NCS):每次实验中都需要用稀释液设置一个 NCS 作为对照样品,NCS 与其他待测样品一起进行 DNA 的提取和纯化操作,以评估在样品处理过程中各操作步骤是否正确,是否存在样品交叉污染或环境污染的情况。
      制备步骤如下:取 1.5 ml 无菌低吸附离心管,加入400μl无菌水,再加入6 μl IC,混匀。
    • 待测样品:在提取支原体样品之前将 IC 添加到样品中,可以作为整个实验过程的质控。制备步骤如下:取 1.5 ml 无菌低吸附离心管,加入 400 μl 样品,再加入 6μl IC,混匀。

 

  • 样品处理

根据样品的体积不同分为两种不同的方式进行处理:对于小于 400 μl 样品不需要浓缩,直接进行后续的 DNA 提取纯化实验;对于大体积(400 μl~2 ml)的样品应先离心浓缩至 400 μl,再进行后续的 DNA 提取纯化实验。具体方法步骤如下:

1、小体积样品(≤ 400 μl)

取 400μl 样品(细菌小于2×109或细胞小于5×107)于 1.5 ml 无菌低吸附离心管中。

2、大体积样品(400 μl~2 ml)

根据是否需要检测样品细胞中的支原体情况,可以选择离心浓缩方式进行:

离心浓缩

  • 取离心去除细胞后的上清,于 4 ℃ 15000 rpm 离心 30min,沉淀支原体颗粒。
  • 离心后,小心用移液枪缓慢吸出上清。注意吸取速度不可太快,枪头不可触碰支原体沉淀颗粒。切忌采用直接倾倒的方式去除上清,以免造成损失。
  • 加入 400 μl ATL,用移液枪吹打或涡旋重悬支原体沉淀,并轻微离心, 将管壁等上面的液滴离心下来。
  • 将上述重悬液转移至 1.5 ml 无菌低吸附离心管中。

注意样品预处理好后需尽快进行下述的DNA 提取实验

操作过程

  1. 在400μl已预处理的样品中加入6ul 内部质控DNA、40μl蛋白酶K(Proteinase K),涡旋震荡10秒以充分混合。
  2. 56°C孵育样品20分钟。
  3. 加入200μl Buffer APL2,关上管盖涡旋振荡30秒。(注意:为了确保足够的裂解,必须将样品和缓冲液APL2充分混合。)
  4. 70°C孵育20分钟。
  5. 瞬时离心将管壁上的液滴流回管底。
  6. 加入300 μl乙醇。关上管盖,涡旋振荡15-30秒以充分混匀。
  7. 小心的吸取600 μl步骤6中的液体,转移至QIAamp UCP Mini spin column(放在2ml的收集管中),注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖,6000 x g (8000 rpm)离心1分钟。把吸附柱转移到一个新的2ml收集管中,弃去旧的收集管。
  8. 将步骤6中剩余的液体加入吸附柱,重复步骤7。
  9. 在吸附柱内小心的加入600μl Bufffer APW1,注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖,6000 x g (8000 rpm)离心1分钟。把吸附柱转移入一个新的2ml收集管,弃去旧的。
  10. 小心的打开吸附柱盖,加入750μl Buffer APW2,注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖,用最大离心速度(20000 x g;12000rpm)离心3分钟。
  11. 建议步骤:将吸附柱放入一个新的2ml收集管,弃去旧的。以最大速度离心1分钟。这一步有助于去除buffer APW2的残留。
  12. 将吸附柱放入一个新的2ml收集管,打开管盖,56°C加热3分钟使膜充分干燥。
  13. 将吸附柱放入一个干净的2ml收集管中,弃去旧的收集管。小心的在吸附柱膜中央加入35μl Buffer AVE。关上管盖,室温孵育1分钟。
  14. (注意:确保Buffer AVE平衡到室温。如果以小体积(<50 μl)进行洗脱,则必须将Buffer AVE加到膜的中心,以完全结合DNA。洗脱体积可根据下游应用的要求进行调整。回收的洗脱液体积,比加在column上的洗脱液体积少5 μl。)
  15. 以最大离心速度(20000 x g ; 12000 rpm)离心1分钟,洗脱核酸。
  16. 重复步骤13和14。

注:洗脱体积为70ul

核酸抽提注意事项

  • 请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测,以保证检测结果的准确性。
  • 由于支原体为病原微生物,提取纯化操作过程建议在二级生物安全实验室或安全柜中进行。
  • 不要将漂白剂或酸性溶液直接添加到含有缓冲APL2或缓冲APW1。如果含有这些缓冲液的液体溢出,用合适的实验室洗涤剂和水清洗。如果溅出的液体含有潜在的传染因子,先用实验室洗涤剂加清水清洗,再加1% (v/v)次氯酸钠清洗。
    样品制备期间:
  • 小心地将样品溶液加到核酸吸附柱上。枪头中的样品进入核酸吸附柱而不湿润柱的边缘。
  • 不同液体在转移之间更换枪头。使用带滤芯的枪头
  • 避免用枪头接触核酸吸附膜。
    操作环境及相关设备耗材
  • 实验所需但试剂盒中未含材料
    • RNase Free Water
    • 无水乙醇(分析纯)
    • PCR 8 连管或 96 孔板,相应管盖或覆膜
    • 1000μl,100μl,10μl 无菌低吸附滤芯枪头
    • 1.5ml,2ml 无菌低吸附离心管

 

  • 相关设备
    • 迷你离心机
    • 漩涡振荡器
    • 恒温水浴锅或金属浴锅
    • 1000μl,100μl,10μl 移液枪
    • 荧光定量 PCR 仪
    • 生物安全柜

 

无菌操作规范

1、除高速离心机外,其他设备和耗材应放在无菌操作台中,保证无菌。

2、样本高速离心后,要对离心管喷酒精,并用棉球擦拭离心管外壁,同时更换干净的板架和新手套。

3、实验前用75%酒精擦净台面及四周,放好需用的实验器材及各种溶液,并用酒精棉球擦拭,更换干净的管架。

4、对着桌面,空间喷洒酒精,然后将超净工作台通风机打开,超净工作台和紫外灯打开 30~45 分钟,再将无菌室紫外灯打开 30~45 分钟后关闭,再通风 15 分钟。关闭紫外,拉开小一半隔离,用酒精棉球擦拭超净工作台桌面2遍,关上隔离。

5、进入无菌室操作前,双手及在操作台内手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿专用工作服、帽及拖鞋、口罩,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用。

6、无菌室温度宜控制在 18~28℃,湿度在 45%~65%(温湿度计应该用无水的)。

7、从枪头盒中取出枪头时,尖部不能触及外露部位及离心管和管架边。

8、操作尽量在酒精灯前操作。打开离心管前,酒精灯灼烧镊子,待冷却后用镊子开关管盖。

9、操作中,不能在样品上方翻转瓶盖,袖口不能掠过样品上方。

10、实验完毕,清洁台面。

11、实验者在实验后用肥皂清洗双手。

12、换下的专用实验服,进行紫外线,一次性鞋套额帽子扔进垃圾桶。

13、用毕,再开紫外灯消毒 30分钟。

14、无菌室和缓冲间定期大扫除,保持整洁。

15、定期检查紫外灯灯管。每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭,除去上面灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响。如灯管发黑,超过使用期限,及时更换紫外灯管。

2、注意事项

(1)工作台面上,禁止存放不必要的物品,以保证工作区域内的洁净气流不受干扰。

(2)禁止在工作台面上记录,工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。(3)根据环境洁净度,每 3~6 个月将中效过滤器中的滤料拆下清洗。一般情况下,当无纺布滤料容纳尘埃较多、表面发黑时即可拆下进行清洗,或者予以更换。

(4)风机转速调至最大时,仍不能达到所需要的风速时(即风速≤0.2m/s),则必须更换高效空气过滤器。说明书

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地 址: 上海市松江区中星创意园2号502

联系人: 李丙卓

电 话: 15966112595

传 真: 021-33559492

Email:libz@biowing.com.cn

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