生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law），又称比尔定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度（absorbance，A）与吸光物质的浓度（consenreation，C）及吸收层厚度（length，L）成正比, 用公式表示为：A = ε*C* L其中A为光度，ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A ₅₀₀= ε₅₀₀ C L（此处ε₅₀₀=34,000M^-1cm^-1）

以Frdbio HABA分析法测算生物素标记效率试剂盒（ARL0021T1）为例，

试剂盒组分：

1.HABA溶液：             1ml    10mM in 0.01M NaOH

2.超纯亲和素（Avidin）     10mg

3.PBS(pH7.2)               30ml     100mM 磷酸钠，150mM NaCl

实验前准备：

HABA- Avidin混合液配制：5mg Avidin和300uL 10mM HABA加入到9.7ml PBS溶液中，（合格标准：1cm比色皿A₅₀₀=0.9 ~ 1.3,）配置好的混合液可以在4℃保存，2周内可以正常使用，如果发现有沉淀或者絮状物，请过滤或者离心后使用。

实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,请稀释待测样品，再次重复此步骤。

微孔酶标板法：

A.     取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），震荡或移液器吹打充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),请稀释待测样品，再次重复此步骤。

标记效率计算方法：

标记摩尔比计算：

生物素：蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

*本试剂仅供实验室研究使用*

案例演示：

以Frdbio超级生物标记试剂盒（货号：ARL0021SK）标记Anti-Covid-19 Spike Mab (货号：nCoV-S-hMab-B)，标记后测算标记比，分光光度计法。

本案例中被标记蛋白为抗体，分子量（MW）为150,000,浓度为5.0mg/mL，A_500(H-A)=1.090，A_500(H-A-BP)=0.585，

抗体摩尔浓度计算：mM /mL=5/150000=3.33*10^-5

ΔA₅₀₀=（0.9*1.090）- 0.585=0.396

生物素摩尔浓度计算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10^-5

抗体：生物素（摩尔比）=(3.33*10^-5)/(1.16*10^-5*10)=1:3.48