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百萤课堂---关于Annexin V的那些疑惑

作者:西安百萤生物科技有限公司 2024-06-11T00:00 (访问量:24358)

1.百萤---Annexin V简介

Annexin V作为一种磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

 

2.百萤---Annexin V适用仪器

Annexin V凋亡检测试剂盒适用仪器:流式细胞仪、 荧光显微镜

 

3.百萤---Annexin V常见问题以及解答

Q:  什么是Annexin V/PI测定?

A:  Annexin V/PI测定用于通过annexin V标记区分早期凋亡细胞和通过丙碘胺(PI)标记区分坏死/死亡细胞。在早期凋亡阶段,细胞膜开始失去不对称性,导致磷脂酰丝氨酸(PS)转位到膜的外表面,在此处annexin V共轭物可以检测到它。然而,在细胞膜破裂的情况下,例如坏死,annexin V共轭物可以进入并结合内层膜中的PS残基,导致假阳性结果。因此,建议使用不透过细胞膜的核染料(如PI)与annexin V共轭物一起使用。这使用户可以区分早期凋亡细胞(annexin V染色)、晚期凋亡细胞(annexin V和PI染色)和坏死细胞(仅PI染色)。

 

Q:  Annexin V是什么颜色的?

A:  就其本身而言,Annexin V 是无色的且难以检测。 为了检测Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合,Annexin V 通常与异硫氰酸荧光素 (FITC) 结合,FITC 是一种绿色荧光化合物,激发峰为 491 nm,发射峰为 516 nm。 用 FITC 或任何其他绿色荧光染料标记Annexin V,例如 iFluor 488(Ex/Em = 491/516 nm)。

 

Q:  Annexin V和TUNEL有什么区别?    

A:  末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 是一种染色方法,用于识别细胞内 DNA 片段化位点——晚期细胞凋亡的标志性特征。 它使用酶末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 将修饰的 dNTP(例如 dUTP)连接到片段化 DNA 链的 3'-羟基末端。 dNTPs 通常用荧光团修饰以促进量化和/或可视化。

Annexin V 染色通过结合由于细胞膜不对称性丧失而暴露在细胞外的 PS 残基来识别细胞凋亡的早期阶段。 Annexin V 通常用 FITC 等荧光团标记,以促进凋亡细胞的检测。

 

Q:  Annexin V阳性是什么意思?

A:  Annexin V阳性结果表明细胞处于凋亡的早期状态,该术语通常用于Annexin V/PI检测,通过根据细胞群的健康状况来区分细胞群。详情如下:

1.Annexin V 阴性/PI阴性:说明细胞很健康

2.Annexin V 阳性/PI阳性:说明该细胞处于坏死或凋亡晚期。

 

Q:  什么是Annexin V的阳性对照?

A:  Annexin V阳性对照是使用已知的细胞凋亡诱导方法诱导凋亡的细胞。 当用Annexin V 偶联物(例如膜联蛋白 V-FITC)染色时,这些细胞会产生阳性信号。 例如,细胞凋亡可通过在 55°C 下加热细胞 20 分钟或处理已知可诱导细胞凋亡的细胞试剂(如喜树碱或星形孢菌素)来诱导。

 

 

Q:  什么是Annexin V结合缓冲液?

A:  在实验样品中,Annexin V结合缓冲液能够促进Annexin V与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。这些结合缓冲液需要含有足够高浓度的钙,使Annexin V与PS结合,但不能高到与其他磷脂结合。Annexin V结合缓冲液也可用于洗涤样品,使其不含过量的膜联蛋白和其他化学残留物质,以确保检测。染色前,应将细胞重悬于浓度为1x10^6/ml的Annexin V结合缓冲液中。

 

Q:  Annexin V是怎样工作的?

A:  Annexin V 通过结合暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 残基来识别正在发生凋亡的细胞。 在活的健康细胞中,PS 残基位于质膜的内层,在那里它们无法与膜联蛋白 V 结合。 当细胞启动程序性细胞死亡(细胞凋亡)时,它们的质膜会失去不对称性。 PS 残基从膜的内部转移到外部小叶,在那里它们可以与膜联蛋白 V 结合。 Annexin V 通常与荧光团(如 FITC)结合,以促进凋亡细胞的检测。

 

Q:  Annexin V染色后,能否进行细胞固定

A:  可以,细胞可以在Annexin V染色后进行固定操作。如果需要固定细胞,请满足以下三个条件:1.使用不含酒精的醛类固定。2.请使用含有CaCl2的缓冲液。3.避免使用洗涤剂或表面活性剂。注意事项:在Annexin V染色前,千万不要固定细胞,固定细胞会杀死细胞,而Annexin V染色只能在活细胞或组织上进行。

 

Q:  Annexin V能染色坏死细胞吗?

A:  是的,Annexin V可以染色坏死细胞。坏死是指不正常的细胞死亡,可能由各种事件触发,包括组织缺血和缺氧或细胞区域的急性损伤。坏死细胞的一个关键特征是质膜破裂。这个事件使得Annexin V可以进入整个质膜,包括PS残基存在的内叶片,导致假阳性。因此,建议使用细胞不渗透染料(例如丙碘锭或7-AAD)与Annexin V结合物相结合,以消除假阳性并区分凋亡细胞和死亡细胞

 

Q:  染色完不能及时上机,样本能固定吗?

A:  细胞染色完成后,禁止固定,应尽快检测,若无法立即检测,可将样本管放冰上,减少外界环境对检测结果的影响,Annexin V 结合不稳定,请务必在标记结束后半小时内检测。

 

Q:  如何统计凋亡细胞数?

A:  Annexin V 凋亡实验在做凋亡统计时一般统计细胞早期凋亡率,也有文献统计总的凋亡比例(早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和)。

Q:血液样本是否可以用于凋亡检测?

A:如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有 PS,能与 Annexin-V 结合,从而对实验结果产生干扰。

Q:有没有更好的办法处理贴壁细胞,来做流式凋亡实验?

A:检测贴壁细胞时,若消化时间不易控制,建议用 Accutase 细胞消化液,对细胞损伤小且不会改变细胞膜上 PS 的分布。

Q:  细胞凋亡早期,可以用Annexin V-FITC/PI双染色法区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞吗?

A:  在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,细胞发生凋亡时,细胞膜发生变化,PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。用荧光素(FITC、Alexa Fluor488等)标记的Annexin-V作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜即可鉴别凋亡细胞和活细胞。

坏死的细胞PS同样也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面,Annexin-V也能识别坏死细胞表面的PS,所以Annexin-V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,能够与细胞内DNA结合,而且它不能透过完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整,PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合,所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞,而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合,坏死细胞内的PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光,被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用,就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

以上就是百萤对Annexin V凋亡检测常见问题的整理,欢迎大家一起讨论。

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