MesenPlify™ 干细胞扩增培养基技术资料(第四期)-技术前沿-资讯-生物在线

MesenPlify™ 干细胞扩增培养基技术资料(第四期)

作者:广州市艾贝泰生物科技有限公司 2024-11-20T00:00 (访问量:8938)

本期主要内容是分享冷冻保存后的hMSCs的如何复苏,hMSCs的传代培养具体的操作流程,成功复苏后操作传代培养,将hMSCs适应到MesenPlifyTM sXF培养基,获得最终实验数据。

hMSCs复苏传代培养操作过程

冷冻保存的hMSCs的复苏

1、将MesenPlifyTM sXF完全培养基提前恢复至室温或37°C。

2、将hMSCs冻存管放置在37°C的水浴中迅速解冻,直到观察到剩余的少量冰晶即将消失。

3、将冻存管内的细胞悬液转移到一个15或50mL锥形管中,缓慢地滴加10mL MesenPlifyTM sXF完全培养基,轻柔混匀。

4、以300xg的速度在室温下离心5分钟收集细胞。 5、弃去上清液以去除二甲基亚砜(DMSO)保护剂。 

6、用1mL MesenPlifyTM sXF完全培养基重新悬浮细胞。 

7、进行细胞计数。

(注意:如果细胞密度超过细胞计数器的推荐范围,可能需要在培养基中进一步稀释样品。) 

8、按照较高的接种密度(5,000-7,000/cm2)将细胞接种到细胞培养容器中,使用MesenPlifyTM sXF完全培养基补充至适当体积。

(TIPS:当细胞刚从冻存中复苏时,建议使用高的接种密度) 

9、在37°C、5% CO₂和饱和湿度的培养箱中培养细胞。

10、每隔3-4天使用预热至37°C的MesenPlifyTM sXF完全培养基进行换液,或传代(当细胞汇合度达到70-80%时,具体操作步骤可参考下文“hMSCs的传代培养”)。

 

hMSCs的传代培养

1、检查hMSCs是否达到70-80%的汇合度。注意不要让hMSCs达到100%的汇合度,否则细胞可能会出现分化的迹象。

2、将MesenPlifyTM sXF完全培养基提前恢复至室温或37°C。

3、用10mL的不含Ca++、不含Mg++的DPBS(不包含在套装中)轻轻洗涤细胞一次。

4、添加复温的0.125%胰蛋白酶消化液(稀释为0.5x使用)或重组胰蛋白酶消化液TrypLE(1×)(不包含在套装中),以覆盖整个组织培养瓶的表面。

5、轻轻旋转培养瓶,使胰蛋白酶均匀分布在表面上。

6、放在37°C培养箱中2-7分钟。 (TIPS:初次使用 MesenPlifyTM sXF完全培养基应摸索合适的消化时间,若细胞刚从FBS培养基中转过来,可能需要5-7分钟。若细胞已完全适应无血清培养,消化时间可能缩短至2-4分钟。 细胞在无血清培养基中较容易消化脱落,此为正常现象,应注意避免消化过度的情况发生,推荐使用重组胰蛋白酶消化液 TrypLE(1×),若采用胰蛋白酶消化液,可稀释到 0.125%(0.5x)使用)。

7、使用相差显微镜检查细胞是否已脱落,轻轻敲击培养瓶的侧面以帮助脱落。 

8、一旦细胞脱落并自由漂浮,将MesenPlifyTM sXF完全培养基添加到消化液体积的3倍,以终止消化。

9、将细胞悬液收集到一个50mL锥形管中。

10、以300xg的速度在室温下离心5分钟。 

11、弃去上清液以去除胰蛋白酶。 

12、用1mL MesenPlifyTM sXF完全培养基重新悬浮细胞。

13、进行细胞计数。(TIPS:如果细胞密度超过细胞计数器的推荐范围,可能需要在培养基中进一步稀释样品。)

14、计算所需的培养基体积,根据实验需要或视细胞状态,以常规的接种密度(3000-5000/cm2)或较高接种密度(5000-7000/cm2)将细胞接种到新的细胞培养器皿中。

15、使用MesenPlifyTM sXF完全培养基补充至适当体积(可参考下表)。 

16、在37°C、5% CO₂和饱和湿度的培养箱中培养细胞。 

17、每隔3-4天使用预热至37°C的MesenPlifyTM sXF完全培养基进行换液,或传代(当细胞汇合度达到70-80%时)。

hMSC传代和培养操作推荐用量: 

 

hMSCs的冷冻保存

1、通过添加20%二甲基亚砜(DMSO,套装中未提供)制备2x的冷冻保存液。

(TIPS:假设最终需要的细胞冻存体积为1mL,先准备500uL的2x冷冻保存液,配制方法是将100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlifyTM sXF完全培养基中)

2、将细胞复温至室温的MesenPlifyTM sXF完全培养基中悬浮,使细胞的浓度为常规细胞浓度的两倍(例如2x106/mL)。

3、将步骤1中制备的2x冷冻保存液,以1:1的体积,缓慢地滴加到细胞悬浮液中,然后用移液管轻轻混合。(此时,冷冻液的浓度被稀释为1x,即DMSO的最终浓度为10%,细胞浓度为1x106/mL)

4、将混合好的细胞悬液,转移到预冷到2- 8°C的细胞冻存管中。

5、转入梯度降温盒,-80℃过夜,隔天转入液氮长期保存。

(TIPS:也可以购买其他商品化的hMSCs冷冻保存液进行冻存,操作步骤参见其说明书进行) 

 

hMSC的特性分析

可以使用流式细胞术、集落形成单位(CFU)分析以及多向分化分析对培养的hMSCs进行特性分析。 详情请参考指南手册获取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells)。

 

将hMSC适应到MesenPlifyTM sXF培养基的过程

如果正在使用其他品牌培养基,可以直接切换到MesenPlifyTM sXF体系,一般情况下无需进行预处理。当细胞刚从冻存中复苏时,也可先用原培养基进行复苏,随后在Day1更换为MesenPlifyTM sXF完全培养基,后续即可正常使用MesenPlifyTM sXF完全培养基培养或传代

 

将hMSC适应到MesenPlifyTM sXF培养基的过程

仅供研究使用(RUO),或用于进一步制造。 

不适用于人类或动物诊断或治疗用途。 

 

产品按照ISO 13408和ISO 9001相关的质量管理体系进行制造。

 

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