对于做分子实验的人来说,探针引物,一个很熟悉的词语,科研人员也会经常用到,但是对于探针引物的设计,您知道多少?今天,我们就简单的谈下这种引物的设计。
通用原则
1. 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针;
2. 扩增子的长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片断越短,有效的扩增反应就越容易获得,较短的扩增片断也容易保证分析的一致性;
3. 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号;
4. 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G);
5. 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
探针设计指导
1. 在设计引物之前设计探针;
2. 探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区;
3. 探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在;
4. 选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
5. 探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
6. 检测探针的DNA折叠和二级结构。
引物设计指导
1. 引物的Tm值应在58-60℃之间,这非常重要,因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃,在这个温度下,5’核酸外切酶的活性最高。
2. 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
3. 将引物尽量接近于探针
循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃,60秒,对于一些模板,45秒也足够了,数据在退火时检测。
优化探针和引物的浓度
对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。引物浓度应该在50nM-900nM 范围内进行优化,探针浓度应该在50-250nM范围内优。探针的浓度应该从(50,100,250nM)与引物浓度相组合,在Rotor-Gene上进行试验,选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM,绝大多数反应都可以在这个浓度下进行,但为了寻找最佳的浓度,还是应该依照上述的步骤。由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序,因此使用三种退火温度(58℃,60℃,62℃)对优化是很有用的。引物的浓度也会影响溶解温度,高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。Primer3是个非常有用的软件,但它不能避免3‘端的G,所以应将3’端的G去除,并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。
定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法:绝对定量和相对定量。研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据。
(1)绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论,理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得,然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因,并与未知样品比较。要注意得是,绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。
在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的R值,反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整,(或重复相同的标准品),这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说,一个单独的标准品就已经足够了,也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。
(2)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率,没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法(⊿⊿Ct)”,这种方法可以彻底不需要标准曲线,通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平,从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功,目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct(相同的起始模板浓度,两个扩增子的两个CT值的差异)随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同,则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线(斜率<0.01)。这意味着在初始模板浓度范围内,两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致,则应该用标准曲线来对基因表达进行定量,或优化反应获得一个类似的效率。
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