慢病毒包装试剂盒
★产品货号
BW12008
★试剂盒内容
1. 慢病毒包装混合物（Lentiviral Packaging Mixture）
2. HET高效转染试剂盒（Cat.No.BW11002）
★慢病毒包装操作手册
1. 在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25%胰蛋白酶消化293T细胞，以含10%血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8X106cells到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80%～90%时即可用于转染。
2. 第二天，在转染前2～4h，用5ml不含P/S的完全培养基换液（DMEM+10% FBS）。
3．按照以下实验步骤来进行转染：
A、加入500ul HET Buffer A到一支洁净的1.5ml EP管中（可标记为A管）
B、在另一支洁净的1.5ml EP管中（可标记为B管），加入以下试剂，终体系为500ul
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试剂名称
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试剂数量
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Vector
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10ul(1.0ug/ul)
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Lentiviral packaging mixture
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15ul(1.0ug/ul)
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HET Buffer B
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50ul
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ddH2O
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425ul
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C、将B管中的DNA温合液缓缓逐滴加入到A管中，用移液器轻轻混匀10min。
D、将混匀后的混合物室温静置30min，然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
3. 第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液（DMEM+10% FBS+P/S）。
4. 第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基（DMEM+10% FBS+P/S）至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。
5. 第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以 0.45 μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。
6. 4℃，50000g 高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记 。
7. 小心弃去上清，晾干，按200ul /10cm培养皿的量加入DMEM（不含血清、双抗）或者PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀（避免产生气泡），继续室温放置30min，吸入到一支洁净的1.5ml EP管中，-80 ℃ 冰箱保存。
8. 在滴度测定前一天取一块48孔板，按照每孔3X104cells的密度接种HEK 293细胞。
9. 加polybrene到新鲜的完全培养基中（DMEM+10% FBS+P/S），使其终浓度为8ug/ml。
10. 用含有polybrene的完全培养基10倍梯度稀释病毒，具体做法如下：取一个96孔板，每孔含有90ul培养基，第一横排孔每孔加入10ul待测病毒原液，混匀后吸取10ul混合液至第二横排孔（混匀时尽量不要产生气泡），如此稀释至第八个孔（即10-8）。
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Titer
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1ul
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0.1 ul
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0.01 ul
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0.001 ul
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0.0001 ul
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Virus Stock
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5 or 10
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10
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10
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10
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10
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Medium with 8ug/ml polybrene
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45 or 90
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90
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90
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90
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90
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Load volume
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10
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10
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10
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10
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10
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11. 各吸取10ul病毒稀释液到相对应的48孔板中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养过夜，16h～24h后用新鲜的完全培养基换液（DMEM+10% FBS+P/S）。
12. 置于37℃，5% CO2 培养箱培养48h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量(如果观察不清晰可以先用PBS，pH7.4换液后再进行观察）。一般情况下，在最高稀梯度m的孔数出现N（N<10）个带荧光的细胞，则病毒滴度为Nx10m/ml（m为稀释倍数）若N>10，则需要继续稀释。
★ 产品用于
仅供研究使用，不适用于人或动物体外治疗与诊断。
★ 产品贮藏条件
-20℃避光保存。
★ 产品运输
冰袋运输。